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PCR反應混合物的分子實驗檢測步驟介紹

釋出時間•↟↟│↟:2022-09-08 00:00:00       點選次數•↟↟│↟:2043

  進行分子實驗檢測時需要先準備PCR反應混合物•↟↟│↟:根據DNA樣本的數量來確定除了DNA外其他混合物的體積(額外增加一份來確保有足夠的PCR反應混合物)✘╃✘,將擴增每一個遺傳標記並且在每一個PCR反應管內分19.5uL的反應混合物•││。
  配製膠溶液•↟↟│↟:將25g尿素·✘、7.5mL40%丙烯醯胺•↟↟│↟:PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中•││。加蒸餾水至50mL✘╃✘,充分混勻來溶解尿素(見註釋4)•││。
  準備制膠板•↟↟│↟:把膠板洗乾淨✘╃✘,確保上面沒有灰塵✘╃✘,用矽化玻璃板•││。根據各個廠家的不同把玻璃板夾在一起並且用膠條封住底部(這一過程根據裝置的不同而有所變化)•││。
  如果不用帶有加熱蓋的PCR儀✘╃✘,那麼就需要在每個管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發•││。
  進行分子實驗檢測時在每個管子中加0.5的DNA樣本•││。
  把管子放在PCR儀中✘╃✘,95℃加熱3min變性DNA•││。
  95℃變性40s·✘、55℃引物退火40s·✘、72℃延伸40s✘╃✘,迴圈30-35次•││。
  把PCR產物和尿素上樣緩衝液1:1混合.
  加入500uL10%的過硫酸銨到膠混合液中並且透過濾紙過濾•││。
  取出10mL膠溶液加入到一個小燒杯中並且加10~15•││。馬上將膠倒到板上•││。幾分鐘之內膠將聚合到一起✘╃✘,封玻璃板的底部•││。
  封好膠後✘╃✘,加15ul到剩餘的膠溶液中並且馬上把膠倒到兩塊膠板之間•││。仔細插入膠梳子✘╃✘,讓膠聚合2h至過夜•││。
  取下膠底部的封條•││。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確•││。將膠槽中灌滿(大約1.5L✘╃✘,根據裝置的不同量有所不同)•││。拔掉膠梳子✘╃✘,沖洗上樣孔•││。
  把膠預熱60min直到溫度在50℃左右•││。
  在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔•││。在每個孔中加產物和上樣染料(上樣量根據梳子的大小和PCR產物的濃度而不同)•││。根據產物片段大小的不同跑膠時間可以從30min到3h之間變化•││。

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