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淺析COIP的正確操作步驟│•↟!小編來帶你瞭解一下│•↟!

釋出時間·│₪•✘:2022-09-08 00:00:00       點選次數·│₪•✘:3108

  淺析COIP的正確操作步驟│•↟!小編來帶你瞭解一下│•↟!
  一│•、細胞的甲醛交聯與超聲破碎(第一天)
  1.取出1平皿細胞(10cm平皿)☁••▩▩,加入243ul37%甲醛☁••▩▩,使得甲醛的終濃度為1%(培養基共有9ml)·▩☁│▩。
  2.37℃孵育10min·▩☁│▩。
  3.終止交聯·│₪•✘:加甘氨酸至終濃度為0.125M·▩☁│▩。450ul2.5M甘氨酸於平皿中·▩☁│▩。混勻後☁••▩▩,在室溫下放置5min即可·▩☁│▩。
  4.吸盡培養基☁••▩▩,用冰冷的PBS清洗細胞2次·▩☁│▩。
  5.細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中(PBS依次為5ml☁••▩▩,3ml和3ml)·▩☁│▩。預冷後2000rpm5min收集細胞·▩☁│▩。
  6.倒去上清·▩☁│▩。按照細胞量☁••▩▩,加入SDSLysisBuffer·▩☁│▩。使得細胞終濃度為每200ul含2x106個細胞·▩☁│▩。這樣每100ul溶液含1x106個細胞·▩☁│▩。再加入蛋白酶抑制劑複合物·▩☁│▩。假設MCF7長滿板為5x106個細胞·▩☁│▩。本次細胞長得約為80%·▩☁│▩。即為4x106個細胞·▩☁│▩。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer·▩☁│▩。將2管混在一起☁••▩▩,共800ul·▩☁│▩。
  7.超聲破碎·│₪•✘:VCX750☁••▩▩,25%功率☁••▩▩,4.5s衝擊☁••▩▩,9s間隙·▩☁│▩。共14次·▩☁│▩。
  二│•、除雜及抗體哺育(第一天)
  1.超聲破碎結束後☁••▩▩,10000g4℃離心10min·▩☁│▩。去除不溶物質·▩☁│▩。
  2.留取300ul做實驗☁••▩▩,其餘保存於-80℃·▩☁│▩。
  3.300ul中☁••▩▩,100ul加抗體做為實驗組;100ul不加抗體做為對照組;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl終濃度為0.2M)☁••▩▩,65℃處理3h解交聯☁••▩▩,跑電泳☁••▩▩,檢測超聲破碎的效果·▩☁│▩。
  4.在100ul的超聲破碎產物中☁••▩▩,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC·▩☁│▩。
  再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA·▩☁│▩。4℃顛轉混勻1h·▩☁│▩。
  5.1h後☁••▩▩,在4℃靜置10min沉澱☁••▩▩,700rpm離心1min·▩☁│▩。
  6.取上清·▩☁│▩。各留取20ul做為input·▩☁│▩。一管中加入1ul抗體☁••▩▩,另一管中則不加抗體·▩☁│▩。4℃顛轉過夜·▩☁│▩。
  三│•、檢驗超聲破碎的效果(第一天)
  1.取100ul超聲破碎後產物☁••▩▩,加入4ul5MNaCl☁••▩▩,65℃處理2h解交聯·▩☁│▩。
  2.分出一半用酚/氯仿抽提·▩☁│▩。電泳檢測超聲效果·▩☁│▩。
  四│•、COIP免疫複合物的沉澱及清洗(第二天)
  1.孵育過夜後☁••▩▩,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA·▩☁│▩。4℃顛轉2h·▩☁│▩。
  2.4℃靜置10min後☁••▩▩,700rpm離心1min·▩☁│▩。除去上清·▩☁│▩。
  3.依次用下列溶液清洗沉澱複合物·▩☁│▩。清洗的步驟·│₪•✘:加入溶液☁••▩▩,在4℃顛轉10min☁••▩▩,4℃靜置10min沉澱☁••▩▩,700rpm離心1min☁••▩▩,除去上清·▩☁│▩。
  洗滌溶液·│₪•✘:
  (1)lowsaltwashbuffer-onewash
  (2)highsaltwashbuffer-onewash
  (3)LiClwashbuffer-onewash
  (4)TEbuffer-twowash
  4.清洗完畢後☁••▩▩,開始洗脫·▩☁│▩。
  洗脫液的配方·│₪•✘:100ul10%SDS☁••▩▩,100ul1MNaHCO3☁••▩▩,800ulddH2O☁••▩▩,共1ml·▩☁│▩。
  每管加入250ul洗脫buffer☁••▩▩,室溫下顛轉15min☁••▩▩,靜置離心後☁••▩▩,收集上清·▩☁│▩。重複洗滌一次·▩☁│▩。最終的洗脫液為每管500ul·▩☁│▩。
  5.解交聯·│₪•✘:每管中加入20ul5MNaCl(NaCl終濃度為0.2M)·▩☁│▩。
  6.混勻☁••▩▩,65℃解交聯過夜·▩☁│▩。
  五│•、DNA樣品的回收(第三天)
  1.解交聯結束後☁••▩▩,每管加入1ulRNaseA(MBI)☁••▩▩,37℃孵育1h·▩☁│▩。
  2.每管加入10ul0.5MEDTA☁••▩▩,20ul1MTris.HCl(PH6.5)☁••▩▩,2ul10mg/ml蛋白酶K·▩☁│▩。45℃處理2h·▩☁│▩。
  3.DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒·▩☁│▩。最終的樣品溶於100ulddH2O·▩☁│▩。
  

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