淺析COIP的正確操作步驟│•↟！小編來帶你瞭解一下│•↟！

　　淺析COIP的正確操作步驟│•↟！小編來帶你瞭解一下│•↟！
　　一│•、細胞的甲醛交聯與超聲破碎（第一天）
　　1.取出1平皿細胞（10cm平皿）☁••▩▩，加入243ul37%甲醛☁••▩▩，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9ml）·▩☁│▩。
　　2.37℃孵育10min·▩☁│▩。
　　3.終止交聯·│₪•✘：加甘氨酸至終濃度為0.125M·▩☁│▩。450ul2.5M甘氨酸於平皿中·▩☁│▩。混勻後☁••▩▩，在室溫下放置5min即可·▩☁│▩。
　　4.吸盡培養基☁••▩▩，用冰冷的PBS清洗細胞2次·▩☁│▩。
　　5.細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中（PBS依次為5ml☁••▩▩，3ml和3ml）·▩☁│▩。預冷後2000rpm5min收集細胞·▩☁│▩。
　　6.倒去上清·▩☁│▩。按照細胞量☁••▩▩，加入SDSLysisBuffer·▩☁│▩。使得細胞終濃度為每200ul含2x106個細胞·▩☁│▩。這樣每100ul溶液含1x106個細胞·▩☁│▩。再加入蛋白酶抑制劑複合物·▩☁│▩。假設MCF7長滿板為5x106個細胞·▩☁│▩。本次細胞長得約為80%·▩☁│▩。即為4x106個細胞·▩☁│▩。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer·▩☁│▩。將2管混在一起☁••▩▩，共800ul·▩☁│▩。
　　7.超聲破碎·│₪•✘：VCX750☁••▩▩，25%功率☁••▩▩，4.5s衝擊☁••▩▩，9s間隙·▩☁│▩。共14次·▩☁│▩。
　　二│•、除雜及抗體哺育（第一天）
　　1.超聲破碎結束後☁••▩▩，10000g4℃離心10min·▩☁│▩。去除不溶物質·▩☁│▩。
　　2.留取300ul做實驗☁••▩▩，其餘保存於-80℃·▩☁│▩。
　　3.300ul中☁••▩▩，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M）☁••▩▩，65℃處理3h解交聯☁••▩▩，跑電泳☁••▩▩，檢測超聲破碎的效果·▩☁│▩。
　　4.在100ul的超聲破碎產物中☁••▩▩，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC·▩☁│▩。
　　再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA·▩☁│▩。4℃顛轉混勻1h·▩☁│▩。
　　5.1h後☁••▩▩，在4℃靜置10min沉澱☁••▩▩，700rpm離心1min·▩☁│▩。
　　6.取上清·▩☁│▩。各留取20ul做為input·▩☁│▩。一管中加入1ul抗體☁••▩▩，另一管中則不加抗體·▩☁│▩。4℃顛轉過夜·▩☁│▩。
　　三│•、檢驗超聲破碎的效果（第一天）
　　1.取100ul超聲破碎後產物☁••▩▩，加入4ul5MNaCl☁••▩▩，65℃處理2h解交聯·▩☁│▩。
　　2.分出一半用酚/氯仿抽提·▩☁│▩。電泳檢測超聲效果·▩☁│▩。
　　四│•、COIP免疫複合物的沉澱及清洗（第二天）
　　1.孵育過夜後☁••▩▩，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA·▩☁│▩。4℃顛轉2h·▩☁│▩。
　　2.4℃靜置10min後☁••▩▩，700rpm離心1min·▩☁│▩。除去上清·▩☁│▩。
　　3.依次用下列溶液清洗沉澱複合物·▩☁│▩。清洗的步驟·│₪•✘：加入溶液☁••▩▩，在4℃顛轉10min☁••▩▩，4℃靜置10min沉澱☁••▩▩，700rpm離心1min☁••▩▩，除去上清·▩☁│▩。
　　洗滌溶液·│₪•✘：
　　（1）lowsaltwashbuffer-onewash
　　（2）highsaltwashbuffer-onewash
　　（3）LiClwashbuffer-onewash
　　（4）TEbuffer-twowash
　　4.清洗完畢後☁••▩▩，開始洗脫·▩☁│▩。
　　洗脫液的配方·│₪•✘：100ul10%SDS☁••▩▩，100ul1MNaHCO3☁••▩▩，800ulddH2O☁••▩▩，共1ml·▩☁│▩。
　　每管加入250ul洗脫buffer☁••▩▩，室溫下顛轉15min☁••▩▩，靜置離心後☁••▩▩，收集上清·▩☁│▩。重複洗滌一次·▩☁│▩。最終的洗脫液為每管500ul·▩☁│▩。
　　5.解交聯·│₪•✘：每管中加入20ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M）·▩☁│▩。
　　6.混勻☁••▩▩，65℃解交聯過夜·▩☁│▩。
　　五│•、DNA樣品的回收（第三天）
　　1.解交聯結束後☁••▩▩，每管加入1ulRNaseA（MBI）☁••▩▩，37℃孵育1h·▩☁│▩。
　　2.每管加入10ul0.5MEDTA☁••▩▩，20ul1MTris.HCl（PH6.5）☁••▩▩，2ul10mg/ml蛋白酶K·▩☁│▩。45℃處理2h·▩☁│▩。
　　3.DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒·▩☁│▩。最終的樣品溶於100ulddH2O·▩☁│▩。